Día Tres

El jueves 29 de Mayo realizamos la técnica de inducción de la reacción acrosomal de los ESP mediante el uso de una molécula que se llama lisofosfatidilcolina (LPC) que se encuentra en los fosfolipidos de membrana. Esta molécula produce fusión de membrana plasmática con la acrosomal externa y permite la vesiculización del acrosoma y liberación del contenido acrosomal (enzimas líticas). Lo que queriamos ver era si los ESP que fueron incubados en condiciones capacitantes eran capaces de sufrir la reaccion acrosomal inducda por LPC. Luego de capacitar a los ESP se separa la poblacion de ESP en dos. Una se incuba 15 min en sp-TALP solo y la otra en presencia de LPC. Luego los ESP fueron lavados y fijados para la evaluación del nº de ESP con acrosoma reaccionado. Esto se midió por la técnica de PSA-FITC (es una lectina que se une específicamente a la manosa unida a una moecula que fluoresce)Contamos en el microscopio la cantidad de ESP reaccionados e intactos en cada tratamiento. Se los veía porque fluorescían, el problema era que al estar expuesto a la longitud de onda seleccionada, con el tiempo la fluorescencia se iba y cada vez costaba más distinguir si estaban reaccionados o no.

Contamos unos 50 ESP por tratamiento (en verdad hay que contar entre 100 y 200, pero como era la primera vez que lo hacíamos contamos menos). Aunque tuvimos ese problema, el total nos dio más o menos igual que cuando María Gracia contó, así que pudimos superar este problema. Hay que restar los reaccionados del tratamiento sín LPC a los reaccionados con el tratamiento con LPC para obtener así los ESP que han reaccionado por acción del LPC y de esta manera se descarta los ESP que reaccionaron sin ser inducidos (reaccion acrosomal espontanea).

Luego ayudamos a Silvina a hacer la segunda parte del Western blot para TRPV1 (un receptor de AEA). Ella ya tenía el "sello" de la corrida de proteínas en el papel de nitrocelulosa, le puso el segundo anticuerpo y luego de los lavados lo incubó con luminol (sustrato de la enzima HRP que esta unida al segundo anticuerpo).

El revelado, se hace con papel de fotografía que se corta al mismo tamaño que el papel de nitrocelulosa, se esperan unos 15 minutos y luego se sumerge el papel fotográfico en revelador hasta que se oscurezca, luego en fijador por unos minutos y después se lava con agua. La placa fotográfica debe ser manejada con guantes para evitar que las huellas dactilares se adhieran a la misma.

En la foto esta cómo nos dio el revelado (no salio muy bueno).

Esta tecnica la describiremos mejor mas adelante.

¡¡Hasta el próximo Jueves!!