Día Cuatro

Hoy 5 de Junio realizamos una capacitación espermática.

Ya lo habíamos hecho el segundo día de la pasantía, pero ese día nosotras contamos los ESP en la cámara de Neubauer y observamos todo el procedimiento que María Gracia realizaba para hacer la capacitación.

Hoy nosotras, junto con María Gracia y Silvina, nos dividimos las tareas y pudimos compenetrarnos más con la práctica. Llevamos a cabo la capacitación de los ESP de Arturo.

Preparamos las columnas de lana de vidrio, les pasamos Sp-TALP, luego descongelamos 3 pajuelas de Arturo y volcamos el contenido en un tubo Falcon, agregamos 1ml de Sp-TALP y pasamos a la suspención de espermatozoides por la columna de vidrio. Luego, llevamos a volumen final de 10 ml con Sp-TALP y centrifugamos.

Nos quedamos con el pellet, lo resuspendimos con Sp-TALP y BSA (sirve para que los ESP no se pegoteen) tomamos 10 microlitros de la solución y contamos al microscopio con la cámara de Neubauer la cantidad de espermatozoides.

Luego tomamos 495 microlitros de esperma y 5 microlitros de la solución correspondiente al tratamiento, en nuestro caso heparina, lo dejamos en la estufa capacitandose durante 45 minutos.

En otro tubo tomamos la misma cantidad de esperma, pero no le ponemos heparina, también lo dejamos en la estufa por 45 minutos. En un tercer tubo pusimos 50 microlitros de esperma, sin heparina, le agregamos 50 microlitros de CTC y 100 microlitros de Glutaraldehido 0.1% (fijador) a este NO lo llevamos a estufa. Después a los tubos que dejamos en la estufa también les pusimos los mísmos microlitros de CTC y Glutaraldehido que en el tubo que no fue a la estufa.

Por último montamos las tres muestras en tres portaobjetos y contamos cuántos intactos, capacitados y reaccionados había por muestra. Aquí también tuvimos el problema de que la fluorescencia se iba y nos costaba más diferenciar los patrones, además de que se cuentan con un objetivo de 20, con lo cual veamos las cabezas de los ESP bastante pequeñas, esto nos dificultó aún más el poder contar.

Obtuvimos un porcentaje de 33.66% en la muetra que estubo a T0 (tiempo cer0), 40% en la muetra s/Hep T45 (sin Heparina, incubada por 45 minutos) y 45.79% en la muetra c/Hep T45 (con Heparina, incubada durante 45 minutos). Nos dió demasiado alto el porcentaje en T0, y en las demás también, es por eso que necesitaremos más práctica y veremos como nos dará la próxima vez que lo hagamos.

¡¡Hasta el próximo Jueves!!

PROYECTO QUIMICA ORT DE GENOMA HUMANO

Investigación en bioquímica molecular y proteómica 2008

Por cuarto año consecutivo, los alumnos del último año de la especialidad química de la Escuela Técnico ORT Argentina realizarán sus proyectos finales en distintas universidades y centros de investigación, con profesionales reconocidos. La metodología de trabajo evita la transposición didáctica, permitiendo a los estudiantes, realizar su actividad final en los lugares donde se está generando el conocimiento.La articulación entre el nivel medio y el posgrado universitario es auspiciada por el CONICET (consejo nacional de investigación científica y técnica). Los proyectos de investigación para el año en curso son:

1) Evaluación de la expresión de la molécula de adhesión cadherina epitelial en tejidos humanos normales y tumorales.
Investigador: Dra. Monica Vazquez-Levin.
Instituto de biología y medicina molecular (IBYME-CONICET).
Alumnos: Yael Dobzewicz y Gala Szapiro.
Blog: http://www.proyecto-6q.blogspot.com/

2) Acción del hexaclorobenceno (HCB) sobre la Uroporfirinógeno descarboxilasa de una línea celular de hepatocitos humanos. Mecanismo de acción.
Investigador: Dra. Maria del Carmen Rios de Molina.
Instituto: Departamento química biológica, facultad de ciencias exactas y naturales.
Alumnos: Lucas Toiw y Uriel Frid.
Blog: http://www.proyectofrid-toiw08.blogspot.com/

3) Modelos experimentales de enfermedades metabólicas: Porfiria y Síndrome Metabólico. Proteómica y Metabolómica de estos disturbios.
Investigador: Dra. Marta Blanca Mazzetti.
Instituto: Departamento de Química Biológica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA).
Alumnos: Maria Duperron y Mauro Elencwajg.
Blog: http://www.proyectofinal6q.blogspot.com/

4) Factores no hemodinámicos relacionados con la génesis y evolución de la proteinuria durante la enfermedad renal progresiva.
Investigador: Dra. Elsa Zotta.
Instituto: Laboratorio de Fisiopatogenia, Departamento de fisiología, Facultad de medicina, UBA.
Alumnos: Barbara Helueni y Melanie Naiman.
Blog: http://www.proyectoq08.blogpsot.com/

5) Estudio de la participación de la anandamida en la regulación de la interacción espermatozoide-oviducto en un modelo bovino.
Investigador: Dra. Silvina Perez Martinez.
Instituto: Facultad de medicina - UBA.
Alumnos: Judith Arenas Tenenbaum y Melina Braverman.
Blog: http://www.scienceproject08.blogspot.com/

6) El estudio de los mecanismos moleculares involucrados en la regulación del gen UGA4 de Saccharomyces cervisiae en respuesta a cambios en la disponibilidad de nutrientes con el fin de dilucidar las distintas cascadas de señales desencadenadas por dichos nutrientes y establecer sus interconexiones.
Investigador: Dra. Susana Correa García.
Instituto: Departamento de Química Biológica, Facultad de ciencias Exactas y Naturales, UBA. Alumnos: Iván Mikiej y Victoria Salama.
Blog: http://www.proyectoquimica22.blogspot.com/

7) Diagnóstico de la enfermedad de Von Willebrand (VWD) tipo 2N por técnicas fenotípicas y genotípicas.
Investigador: Dra. Adriana I. Woods.
Instituto: Instituto de Investigaciones Hematológicas "Mariano R. Castex" de la Academia Nacional de Medicina.
Alumnos: Abigail Skverer y Daniela Lin.
Blog: http://www.vwd-diagnostico.blogspot.com/

8) Estudio de la mielinogenesis en el sistema nervioso periférico en condiciones fisiológicas y patológicas. Participación de células pluripotentes en el proceso de degeneración-regeneración nerviosa.
Investigador: Dra. Patricia Setton-Avruj.Instituto: Departamento de Química Biológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica (IQUIFIB-UBA-CONICET).
Alumnos: Daniel Averbuj y Eitan Rozenszajn.
Blog: http://www.proyectoaverbuj-rozenszajn.blogspot.com/

9) Diseño y desarrollo de vacunas antitumorales empleando bacterias y células tumorales modificadas con genes inmunomodiladores. Estudio de los mecanismos inmunes inducidos. Investigador: Claudia I. Waldner y Claudia Mongini.
Instituto: Laboratorio de inmunológica celular y molecular. Centro de Estudios Farmacológicos y Botánicos (CEFYBO. CONICET-UBA).
Alumnos: Amalia Surijon y Maria Belen Tolava Rivero.
Blog: http://www.amibeluproyecto.blogspot.com/

10) Marcadores Genéticos Asociados al Cáncer.
Investigador: Dr. Javier Hernán Cotignola.
Instituto: Laboratorio de Cáncer y Apoptosis del Departamento de Química Biológica de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la UBA.
Alumnos: Ayelén Marano y Solange Perchik.
Blog: http://www.marcadoresgeneticos.blogspot.com/

11) Expresión del canal de la conductancia transmembranal de la Fibrosis Quistica (CFTR) en placentas Preeclampticas: posible rol en la regulación de la actividad de la Acuoporina-9 (AQP9).
Investigador: Dr. Alicia E Damiano.Instituto: Cátedra de Biología Celular, Departamento de Ciencias Biológicas, Facultad de Farmacia y Bioquímica (UBA).
Alumnos: Gabriel Colodenco y Martín Sapir.
Blog: http://www.proyectofinalcs.blogspot.com/

12) Proteómica de factores secretados por células de cáncer de mama y mama normal con capacidad inhibitoria de la producción lipídica.
Investigador: Dra. Guerra de Grignoli Liliana Noemi.
Instituto: Departamento de Ciencias biológicas. Facultad de ciencias exactas y naturales, UBA-CONICET.
Alumnos: Fabiana Durante y Tamara Broitman.
Blog: http://tyf-proyecto08.blogspot.com/

13) Estudio de la Growth Associated Protein (GAP-43), su interacción con la Ubicutina y su participación en el control del ciclo celular en células NIH3T3 transfectadas en forma estable y transiente. Efecto de la Apo-transferrina en la remielización: participación de la vía Notch en la diferenciación oligodendrioglial.
Investigador: Dra. Ana M. Adamo.
Instituto: Departamento de Química Biológica Patológica, Facultad de Farmacia y Bioquímica de la UBA. CONICET.
Alumnos: Rodrigo C. Pampin y Robby Mattes.
Blog: http://www.proyectodeatuyrobby.blogspot.com/

14) Neovascularización en un modelo murino de inflamación aguda inducida por LPS.
Investigador: Eulalia de la Torre.
Instituto: Facultad de Medicina - UBA - Laboratorio de Inmunofarmacología.
Alumnos: Federico Mauas Walach y Pablo Kuleff.
Blog: http://finalproyectort.blogspot.com/

15) Interacción de sumo-1 y mage-a2 en la regulación del oncosupresor p53.
Investigador: Martín Monte.
Instituto: Facultad de Ciencias Exactas y Naturales (UBA).
: Leonel Stermann y Yair Litman Blog: http://proyectosumo.blogspot.com/

Día Tres

El jueves 29 de Mayo realizamos la técnica de inducción de la reacción acrosomal de los ESP mediante el uso de una molécula que se llama lisofosfatidilcolina (LPC) que se encuentra en los fosfolipidos de membrana. Esta molécula produce fusión de membrana plasmática con la acrosomal externa y permite la vesiculización del acrosoma y liberación del contenido acrosomal (enzimas líticas). Lo que queriamos ver era si los ESP que fueron incubados en condiciones capacitantes eran capaces de sufrir la reaccion acrosomal inducda por LPC. Luego de capacitar a los ESP se separa la poblacion de ESP en dos. Una se incuba 15 min en sp-TALP solo y la otra en presencia de LPC. Luego los ESP fueron lavados y fijados para la evaluación del nº de ESP con acrosoma reaccionado. Esto se midió por la técnica de PSA-FITC (es una lectina que se une específicamente a la manosa unida a una moecula que fluoresce)Contamos en el microscopio la cantidad de ESP reaccionados e intactos en cada tratamiento. Se los veía porque fluorescían, el problema era que al estar expuesto a la longitud de onda seleccionada, con el tiempo la fluorescencia se iba y cada vez costaba más distinguir si estaban reaccionados o no.

Contamos unos 50 ESP por tratamiento (en verdad hay que contar entre 100 y 200, pero como era la primera vez que lo hacíamos contamos menos). Aunque tuvimos ese problema, el total nos dio más o menos igual que cuando María Gracia contó, así que pudimos superar este problema. Hay que restar los reaccionados del tratamiento sín LPC a los reaccionados con el tratamiento con LPC para obtener así los ESP que han reaccionado por acción del LPC y de esta manera se descarta los ESP que reaccionaron sin ser inducidos (reaccion acrosomal espontanea).

Luego ayudamos a Silvina a hacer la segunda parte del Western blot para TRPV1 (un receptor de AEA). Ella ya tenía el "sello" de la corrida de proteínas en el papel de nitrocelulosa, le puso el segundo anticuerpo y luego de los lavados lo incubó con luminol (sustrato de la enzima HRP que esta unida al segundo anticuerpo).

El revelado, se hace con papel de fotografía que se corta al mismo tamaño que el papel de nitrocelulosa, se esperan unos 15 minutos y luego se sumerge el papel fotográfico en revelador hasta que se oscurezca, luego en fijador por unos minutos y después se lava con agua. La placa fotográfica debe ser manejada con guantes para evitar que las huellas dactilares se adhieran a la misma.

En la foto esta cómo nos dio el revelado (no salio muy bueno).

Esta tecnica la describiremos mejor mas adelante.

¡¡Hasta el próximo Jueves!!