Día Quince

El Jueves 16 de Octubre trabajamos con lo co-cultivos; los culitivos de células ciliadas del endometrio de la vaca, a los cuales ya les habían puesto los ESP y ya habían sido lavados auqellos que no se aferraron a estas células por estar capacitados.

Hay que contar 20 campos por muetra (pool) con el cuenta ganado y anotarlos en una planilla para luego sacar el promedio de la cantidad que hay.

El problema que tubimos a lo largo de toda la observación es que costaba distinguir los ESP de las células epiteliales, había que mover mucho el micro para poder verlas y el fondo tenia casi el mísmo color que los ESP, fue muy dificultoso contarlas y había que forzar bastánte la vista. Pero finalmente logramos hacerlo bastante bien.

Durante este día pudímos terminar con una de las muestras y comenzar con otra, el próximo jueves también estaremos haciendo esto.

Esto se hace para ver si hay una cierta concentracion de AEA capaz de despegar a los ESP de las células ciliadas.

Dia Catorce

Hoy Jueves 2 de Octubre terminamos la inmunocitoquímica que largamos el anterior Jueves, lo siguiente es el protocolo que seguimos para realizarla:

Obtención de los ESP bovinos

Las pajuelas de ESP fueron descongeladas y lavadas por centrifugación para descaratar el medio en el que esatban criopresenvados. Luego el pellet fue resuspendido en 1ml y los ESP fueron contados en una camara de Newbauer para obtener la concentración ideal ara utilizar en preparados de inmunocitoquímica (50 a 100 mil ESP/Well), despues loe ESP fueron colocados en portaobjetos para realizar la inmunocitoquímica.


Inmunocitoquímica o Inmunoohistquímica

Los ESP fueron permeabilizados con metanol 100% a -20ºC durante 10 minutos, luego fueron lavados con PBS para sacar el exceso de metanol. Posteriormente las muestras fueron tratadas con una solución de bloqueo (para bloquear los sitios de unión inespecíficos del anticuerpo secundario) conteniendo PBS-BSA (40mg/ml) durante 1 hora a temperatura ambiente. Al cabo de ese tiempo se levantó la solución de bloqueo y se incubó con el primer anticuerpo según la siguiente tabla:

1ºAnticuerpo, origen, dilución y función (orden)

- TRPV1; Conejo; 1/20; Receptor endovalinoide con sitio de unión a la AEA endógeno.

- CB1; Conejo; 1/20; Receptor de endocanabinoides sitio de unión de AEA exógeno.

- CB1; Conejo; 1/20; Receptor de endocanabinoides sitio de unión de AEA exógeno.


los cuáles fueron incubaso toda la nochea 4ºC. Despues de esta incubación, los preparados fueron lavados tres veces con PBS TWEEN 20 0.1% durante 5 minutos (para evitar uniónes inespecíficas del primer anticuerpo, sacar las uniónes láviles).

Se incubó con un segundo anticuerpo (un anti IgG de conejo hecho en cabra, acoplado a una molécula de Rodamina; Alexa 555) en una concentración de 1 /250 en PBS durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego se hicieron tres lavados con PBS TWEEN 20 0.1% y los ESP fueron montados en una solución de PBS Glicerol 1:9.

En el B y su contraste el A se puede ver la fluorecencia del segundo anticuerpo en sus colas (también la vimos en sus cuñas, el borde de las cabezas, pero en la foto no salió), y en las imágenes C y D se ve el control negativo, donde no hay fluorecencia.

También observamos, al microscopio, células ovioductales. Estas se encontraban en movimiento por el batido ciliar y con el tienpo se irán anclando en el medio y comenzarán a extenderse. Aquí es dónde sembraremos los ESP para ver como reaccionan ante la AEA (si se capacitan o no, o si se desprenden de las células ovioductales o no).